大家好，

又到了我們每周一的干貨時間。

大家還記得第yi期干貨

嗎？

文中仔細(xì)分析了在SPE的基本操作階段中

引發(fā)流速慢這類問題的主要原因。

今天我們主要給大家分享一下，

在方法偏離的情況下,

如何對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行有效優(yōu)化。

在實(shí)驗(yàn)過程中，我們經(jīng)常遇到方法偏離。方法偏離主要是發(fā)生在人機(jī)料法環(huán)測這幾個方面。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到的樣品量不同，前處理儀器不同這些都是很常見的偏離問題。那么在面對這樣的問題的時候，我們該怎樣對于整個樣品前處理過程的產(chǎn)生一個合理分析并對實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行有效的優(yōu)化調(diào)整呢？

今天我們給大家分享一個案例，通過這個案例，希望對您的實(shí)驗(yàn)有所啟發(fā)。

這個案例來自我們的客戶A。客戶A是做雪碧里合成著色劑檢測。參考標(biāo)準(zhǔn)是GB 5009.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》。這個標(biāo)準(zhǔn)適用于飲料、配制酒、硬糖、蜜餞、淀粉軟糖、巧克力豆及著色糖衣制品中合成著色劑的測定，標(biāo)準(zhǔn)中用聚酰胺粉末吸附法或液液萃取分配法提取食品中人工合成著色劑，將其制成水溶液，再用高效液相色譜儀分析。這個國標(biāo)的檢測方法比較繁瑣，并且赤蘚紅不能與其他色素一起測定，應(yīng)用到實(shí)際檢測時，很多老師都覺得實(shí)驗(yàn)過程過于復(fù)雜，難于操作。

針對這個國標(biāo)，安譜實(shí)驗(yàn)對其方法進(jìn)行了優(yōu)化，并且成功開發(fā)了食品中合成著色劑檢測小柱。采用高效液相色譜法來同時檢測食品中8種合成著色劑（莧菜紅、新紅、赤蘚紅、胭脂紅、日落黃、檸檬黃、亮藍(lán)，靛藍(lán)），方法簡單易行，且回收率高，深受廣大用戶的歡迎。

案例中的客戶A就是使用安譜實(shí)驗(yàn)的合成著色劑小柱（SBEQ-CA73-GBT5009.35）來實(shí)驗(yàn)的。客戶在20g的雪碧樣品里面加20ul,1000ug/ml的色素混標(biāo)，采用全自動固相萃取儀按照安譜實(shí)驗(yàn)合成著色劑柱的實(shí)驗(yàn)方法中SPE的洗脫程序運(yùn)行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亮藍(lán)在的回收率不佳。客戶希望我們能幫忙優(yōu)化下實(shí)驗(yàn)方法。

面對客戶對實(shí)驗(yàn)步驟優(yōu)化的訴求，我們仔細(xì)分析了客戶目前的實(shí)驗(yàn)方法。

根據(jù)表格中兩種方法的對比，可以看出客戶和安譜實(shí)驗(yàn)合成著色劑柱方法主要不同點(diǎn)是樣品量不同而帶來的。一是客戶是按照國標(biāo)的取樣要求，需要20g的樣品。而我們實(shí)驗(yàn)單頁的樣品取樣量則為1g，具體到上樣量，客戶的上樣量是約23ml，而我們的上樣量約12ml。客戶的上樣量約為我們的2倍，二是客戶的淋洗液和洗脫液也根據(jù)上樣量而都擴(kuò)大了2倍。后就是客戶是用自動固相萃取裝置進(jìn)行SPE操作的，和手動的固相萃取方法在流速控制上還是有差異的。由此可見，客戶的方法偏離主要體現(xiàn)在樣品取樣量，溶劑體積以及所用的儀器上。

客戶反饋實(shí)驗(yàn)結(jié)果亮藍(lán)的回收率不佳，希望能夠改善亮藍(lán)的回收率。針對客戶的訴求，我們應(yīng)該有如下思路來解決這個回收率的問題。

1  確定目標(biāo)化合物主要損失步驟

亮藍(lán)的回收率不佳，說明亮藍(lán)在洗脫前的實(shí)驗(yàn)過程中有損失。針對這種情況，我們需要先確定亮藍(lán)的主要損失步驟。

這里我們可以引入SPE操作過程中一個非常實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技巧——分步收集。

分步收集就是通過收集上樣液，淋洗液，洗脫液,并上機(jī)分析，從而判斷目標(biāo)化合物具體損失的環(huán)節(jié)，明確實(shí)驗(yàn)步驟中具體需要優(yōu)化的環(huán)節(jié)。

根據(jù)我們的建議，客戶先實(shí)施了分步收集，發(fā)現(xiàn)亮藍(lán)在上樣液中未被檢出，淋洗環(huán)節(jié)有檢出。說明亮藍(lán)在小柱上能夠很好的被吸附，所以上樣液中無亮藍(lán)。但是在淋洗的時候被洗脫下來，所以淋洗部分是亮藍(lán)回收率損失的主要部分。

2  分析目標(biāo)化合物主要損失的原因

通過前面分步收集，我們發(fā)現(xiàn)客戶的樣品中亮藍(lán)的主要是在淋洗過程中損失的。那么接下來就需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理分析亮藍(lán)損失的原因。

合成著色劑小柱的填料可與酚類、酸類、蒽醌類等成分形成氫鍵，因而產(chǎn)生吸附作用。合成著色劑的分子結(jié)構(gòu)中帶有磺酸基團(tuán)，羥基等。故能在酸性溶液中能與人工合成色素形成氫鍵牢固地結(jié)合，從而與天然色素、蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉等物質(zhì)分離。然后在堿性條件下能夠解吸色素。但填料對天然色素的吸附并不不緊密，天然著色劑在酸性條件下能夠被去除。所以在我們的實(shí)驗(yàn)過程中，會用甲醇-甲酸-水溶液去淋洗小柱，去除天然色素的干擾。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理我們不難發(fā)現(xiàn)，淋洗的目的主要是去除天然色素的干擾。而我們的目標(biāo)化合物亮藍(lán)是一種易溶于水的合成著色劑。不難發(fā)現(xiàn)，在這種情況下，淋洗溶液和亮藍(lán)之間也會存在一定的分子間作用力，當(dāng)淋洗液體積達(dá)到一定程度的時候，極易溶于水的亮藍(lán)就容易被淋洗液淋洗下來。

3  提出合理的改進(jìn)意見

根據(jù)前面的步驟我們發(fā)現(xiàn)淋洗液和目標(biāo)化合物亮藍(lán)之間的分子間作用力可能是造成亮藍(lán)損失的主要原因。那么在這種情況下我們需要怎樣改進(jìn)實(shí)驗(yàn)過程呢？針對這個案例我們考慮到客戶基質(zhì)是碳酸飲料雪碧，本身基質(zhì)中成分比較簡單。而淋洗的目的主要是去除天然色素，所以在對于雪碧這種基質(zhì)而言淋洗這一步并不是關(guān)鍵步驟，可以減少用量。建議將10ml的淋洗液體積降至5ml，并且適當(dāng)降低流速。

4  實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

客戶根據(jù)我們的建議改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件后，發(fā)現(xiàn)亮藍(lán)在淋洗時不再被洗脫下來，回收率能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

根據(jù)上面的案例分析，我們不難發(fā)現(xiàn)，在面對實(shí)際檢測工作中的方法偏離問題時，我們需要做的是冷靜的比較方法的主要偏離點(diǎn)，并明確目標(biāo)化合物的主要損失步驟，經(jīng)過仔細(xì)思考，大膽推測，認(rèn)真實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證找到解決問題的方向。

路漫漫其修遠(yuǎn)兮，

吾將上下而求索。

實(shí)驗(yàn)過程本身就是不斷探索創(chuàng)新的過程，

遇到困難和問題不用慌張，

安譜實(shí)驗(yàn)一直在您身邊，

更多檢測標(biāo)準(zhǔn)解讀

專家培訓(xùn)課程

技術(shù)經(jīng)驗(yàn)干貨分享

VX關(guān)注公眾號：安譜實(shí)驗(yàn)學(xué)堂